如何完成質(zhì)粒DNA提取實(shí)驗(yàn)

在我們的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常會(huì)用到質(zhì)粒DNA，現(xiàn)在都用劑盒非常方便，而且菌體培養(yǎng)后，可以多管濃縮提取，提到的質(zhì)粒量多，可以

-20℃保存，以后用于酶切、轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)，可以提前跑個(gè)膠，只要不降解，就可以繼續(xù)用，避免每次要用，都要培養(yǎng)一遍再提取

一遍。

質(zhì)粒DNA的提取

質(zhì)粒多為一些雙鏈、環(huán)狀的DNA分子，是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。質(zhì)粒是進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

操作，進(jìn)行遺傳工程改良物種等工作時(shí)最主要的DNA載體。

實(shí)驗(yàn)步驟

1.搖菌培養(yǎng)

1）將鑒定測(cè)序正確的克隆菌液涂在LB固體平板。

2）置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12-17h，待長(zhǎng)出菌落。

3） 滅菌15ml離心管內(nèi)加入5ml含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，編號(hào)標(biāo)記。

4） 挑取單克隆菌團(tuán)放置液體培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)基放置1個(gè)菌落。

5） 37℃，180rpm，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。

2.收獲細(xì)菌并裂解

1） 離心擴(kuò)增好的菌液，按說(shuō)明書將菌液重懸，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中。

2）用質(zhì)粒小量抽提試劑盒，按說(shuō)明書要求提取質(zhì)粒。

3） 細(xì)菌高速離心1min,去除上清。

4）加入250ulRB溶液，振蕩器充分懸浮細(xì)菌。

5）加入250ulLB溶液。立即上下顛倒10次，使細(xì)菌裂解，室溫，放置2min。

6）加入250ulNB溶液。立即上下顛倒10次，使之充分中和，室溫，放置2min。

7）室溫，1500rpm，高速離心15min。

8）將吸附柱放入收集管內(nèi)，離心得到的上清轉(zhuǎn)移至吸附柱，室溫，15000rpm，高速離心30s。

9）棄廢液，將吸附柱放入收集管，加入700ul WB溶液到吸附柱中，15000rpm，高速離心30s。

10）重復(fù)上一操作。

11）將吸附柱放入干凈的1.5ml 離心管中，加30-50ul預(yù)熱的Elution Buffer，室溫，放置2min，高速離心1min。

12）樣品進(jìn)行電泳檢測(cè)：1%瓊脂糖凝膠電泳，上樣量為2ul，紫外燈下觀察，最明亮的帶為超螺旋形式，可以在一定程度上表明提取質(zhì)粒的純度。

3.質(zhì)粒的純化

1）將之前提取好的質(zhì)粒放入1.5ml離心管中，加入1/10體積的3mol/L 無(wú)菌乙酸鈉溶液。

2）加入2倍體積的無(wú)水乙醇，放置于-20℃沉淀4-6h或過(guò)夜。

3）4℃，高速離心機(jī)14000rpm，離心20min.

4）棄去上清，70%乙醇洗2次。

5）空氣干燥，可置超凈工作臺(tái)干燥。

6）加200ul無(wú)菌水溶液干燥后所得沉淀，即為質(zhì)粒溶液。

7）紫外分光光度計(jì)測(cè)量質(zhì)粒濃度和產(chǎn)量。

測(cè)量OD260和OD280的值：質(zhì)粒DNA濃度=OD260×50×稀釋倍數(shù)（μg/mL）。

10個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題

一.時(shí)間控制問(wèn)題

裂解時(shí)間太長(zhǎng)，加入溶液P2后裂解時(shí)間不應(yīng)超過(guò)5 分鐘；吸附時(shí)間不夠；溶解時(shí)間不夠都會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒DNA提取實(shí)驗(yàn)失敗。

二.大腸桿菌老化

建議涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。

三.質(zhì)粒拷貝數(shù)低

由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA 提取量低，可更換具體相同功能的高拷貝數(shù)載體。

四.溶液使用不當(dāng)溶液P2、P3 在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁，應(yīng)置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。

五.吸附柱過(guò)載

不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請(qǐng)分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如TB 或者 ×YT 菌液體積必須

減少；若質(zhì)粒或宿主菌是非常高的拷貝數(shù)或生長(zhǎng)率，則需調(diào)整LB 培養(yǎng)液體積。

六.質(zhì)粒未全部溶解

洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當(dāng)加溫或延長(zhǎng)溶解時(shí)間。

七.乙醇?xì)埩?/span>

漂洗液洗滌后應(yīng)離心盡量去除殘留液體，樹脂型試劑盒漂洗后應(yīng)晾干樹脂，再加入洗脫緩沖液。

八.洗脫液加入位置不正確

洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會(huì)覆蓋硅膠膜的表面達(dá)到最大洗脫效率。

九.洗脫液不合適

DNA 只在低鹽溶液中才能被洗脫。洗脫效率取決于pH 值。最大洗脫效率在pH7.0～ 8.5 間。當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其 pH 值在此

范圍內(nèi)，如果pH 過(guò)低可能性導(dǎo)致洗脫量低。洗脫時(shí)將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加暖至 60 ℃后使用有利于提高洗脫效率。

十.洗脫體積太小

洗脫體積對(duì)來(lái)回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。

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