細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)之電穿孔轉(zhuǎn)染法

一般來(lái)說(shuō)重組DNA轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞之后才能得到擴(kuò)增，轉(zhuǎn)染是常用的方法之一。細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)服務(wù)是將外源DNA、RNA直接導(dǎo)入真核細(xì)胞的

技術(shù)服務(wù)，可用于基因功能研究、調(diào)控基因表達(dá)、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)試驗(yàn)服務(wù)中。選擇合適的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方式對(duì)于細(xì)胞生物學(xué)、

分子生物學(xué)以及腫瘤防治等科學(xué)研究具有十分重要的意義。電穿孔法是常用的細(xì)胞轉(zhuǎn)染的物理方法，它應(yīng)用高壓電擊短暫或穩(wěn)定地將DNA

導(dǎo)入細(xì)胞，適用于用化學(xué)或物理方法轉(zhuǎn)染某些類型細(xì)胞效率不高或有毒性時(shí)。

1、什么是電穿孔法

電穿孔法適用于多種類型的細(xì)胞，即可產(chǎn)生高頻率的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，又可產(chǎn)生短暫的基因表達(dá)，并且其所需步驟較少，因而比其他技術(shù)更為容易

。在電穿孔方法中，電流能夠可逆地?fù)舸┘?xì)胞膜形成瞬時(shí)的水通路或膜上小孔促使DNA分子進(jìn)入胞內(nèi)。電穿孔法可用于基因克隆、外源基因

的表達(dá)、基因定位和基因圖譜的繪制等研究。美迪西提供新藥研發(fā)外包服務(wù)，其生物部在分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、體外生物學(xué)和結(jié)構(gòu)生物

學(xué)領(lǐng)域有豐富廣泛的經(jīng)驗(yàn)。可以從最初的cDNA文庫(kù)構(gòu)建到藥物設(shè)計(jì)，通過(guò)蛋白質(zhì)純化，結(jié)構(gòu)測(cè)定和分析測(cè)定，提供一套完整的生物學(xué)服務(wù)。。

電穿孔轉(zhuǎn)染法首先利用電轉(zhuǎn)緩沖液重懸細(xì)胞→對(duì)含有核酸，緩沖液，細(xì)胞的混合物給予合適的電脈沖→電脈沖在細(xì)胞膜上形成電勢(shì)差，

誘導(dǎo)產(chǎn)生暫時(shí)的孔使核酸進(jìn)入細(xì)胞→將細(xì)胞返回到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，使其慢慢恢復(fù)→檢測(cè)基因表達(dá)或沉默情況。該方法適用范圍廣、

轉(zhuǎn)化效率高、殘毒性小，是具有發(fā)展?jié)摿Φ囊环N轉(zhuǎn)染方法之一。

近年來(lái)也出現(xiàn)了活體電穿孔法用于轉(zhuǎn)基因的研究，活體電穿孔法是將外源基因通過(guò)電場(chǎng)作用，導(dǎo)入動(dòng)物目標(biāo)組織或器官。由于這種方法能有

效導(dǎo)入外源基因，可在多種組織器官上應(yīng)用，并且效率較高。活體電穿孔法的原理很簡(jiǎn)單，在直流電場(chǎng)作用的瞬間，細(xì)胞膜表面產(chǎn)生疏水或

親水的微小通道105～115μm；這種通道能維持幾毫秒到幾秒，然后自行恢復(fù)，在此期間生物大分子如DNA可通過(guò)這種微小的通道進(jìn)入細(xì)胞。

一般情況下，高電場(chǎng)強(qiáng)度會(huì)殺死50%-70%的細(xì)胞。現(xiàn)在針對(duì)電穿孔轉(zhuǎn)染會(huì)引起大量細(xì)胞死亡而開發(fā)出了一種電轉(zhuǎn)保護(hù)劑，可以大大的降低

細(xì)胞的死亡率，同時(shí)提高電穿孔轉(zhuǎn)染效率。當(dāng)遇到某些脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率很低或兒乎無(wú)法轉(zhuǎn)入時(shí)建議使用電穿孔法轉(zhuǎn)染。有研究者進(jìn)行了電穿

孔法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染效率的比較。

2、電穿孔轉(zhuǎn)染法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染效率比較研究

研究者通過(guò)對(duì)電穿孔轉(zhuǎn)染法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法在K562、HepG2細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率比較，探索最佳的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法和條件[1]。方法是以K562、

HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，采用電穿孔轉(zhuǎn)染法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染帶有綠色熒光的質(zhì)粒PEGFP-N1和無(wú)熒光的質(zhì)粒pCDNA3.1、

pCDNA3.1-EOS基因，熒光顯微鏡下觀察PEGFP-N1轉(zhuǎn)染效果，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率；收集各培養(yǎng)組細(xì)胞，裂解后提取蛋白，采用Western印跡

分析方法檢測(cè)基因轉(zhuǎn)染后的蛋白表達(dá)。

結(jié)果當(dāng)脈沖20ms、電阻90Ω、電壓150V時(shí)進(jìn)行電穿孔，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒PEGFP-N1，K562細(xì)胞可以得到較高的轉(zhuǎn)染率；當(dāng)脈沖20ms、電阻90Ω、

電壓250V時(shí)，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒PEGFP-N1，HepG2細(xì)胞可以得到較高的轉(zhuǎn)染效率。在K562細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中，電穿孔轉(zhuǎn)染法的轉(zhuǎn)染效率均顯著

高于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(P<0.05)。電穿孔轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染PEGFP-N1后K562細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的存活率顯著低于脂質(zhì)體法(P<0.05)。Western blo

t結(jié)果顯示電穿孔轉(zhuǎn)染法蛋白表達(dá)量高于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(P<0.05)。因此最佳條件下電穿孔轉(zhuǎn)染法是一種高效的基因轉(zhuǎn)染方法，對(duì)比較難轉(zhuǎn)染的

懸浮細(xì)胞效果更佳。

如今電穿孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法應(yīng)用范圍越來(lái)越廣泛，例如將該項(xiàng)技術(shù)用于核酸疫苗的轉(zhuǎn)遞、通過(guò)質(zhì)粒或外來(lái)基因轉(zhuǎn)染原生動(dòng)物、非熱效應(yīng)殺滅腫

瘤細(xì)胞、向正常組織或腫瘤組織中轉(zhuǎn)入治療性蛋白基因等的研究。隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)電穿孔技術(shù)研究的深入，其在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用前景

將會(huì)越來(lái)越廣闊。

[1]電穿孔轉(zhuǎn)染法與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法對(duì)K562和HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響[J].