1.慢病毒載體概述

慢病毒載體（Lentivirus）是一類改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒載體，是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，基因組是RNA，其毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的基因所取代，屬于假型病毒。可利用逆轉(zhuǎn)錄酶將外源基因整合到基因組中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)，具有感染分裂期與非分裂期細(xì)胞的特性。
慢病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞漿中反轉(zhuǎn)錄為DNA，形成DNA整合前復(fù)合體，進(jìn)入細(xì)胞核后，DNA整合到細(xì)胞基因組中。整合后的DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA，回到細(xì)胞漿中，表達(dá)目的蛋白；或產(chǎn)生小RNA。慢病毒介導(dǎo)的基因表達(dá)或小RNA干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定，并隨細(xì)胞基因組的分裂而分裂（圖1）。

 

慢病毒載體具有宿主范圍廣，免疫原性低，基因容量大，可以長(zhǎng)期表達(dá)等特點(diǎn)。能夠有效地感染培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞。

慢病毒的感染具有整合特性，能夠?qū)⑼庠椿蛴行У卣系剿拗魅旧w上，達(dá)到持久性表達(dá)，因而可構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，用于基因的細(xì)胞功能研究。使用慢病毒載體改造T細(xì)胞可用于CAR-T細(xì)胞治療，CRISPR/Cas9文庫(kù)構(gòu)建使用的也是慢病毒載體。

2.慢病毒包裝與純化

慢病毒包裝采用三質(zhì)粒或四質(zhì)粒系統(tǒng)進(jìn)行包裝，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，通過(guò)超速離心濃縮純化和收集病毒。

3.慢病毒滴度檢測(cè)

檢測(cè)方法：定量PCR檢測(cè)干擾后細(xì)胞基因組中外源DNA拷貝數(shù)
實(shí)驗(yàn)原理：慢病毒介導(dǎo)外源基因以逆轉(zhuǎn)錄方式整合進(jìn)目的細(xì)胞基因組

4.慢病毒載體優(yōu)勢(shì)

①  表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)：慢病毒可將外源基因整合到宿主細(xì)胞基因組上，實(shí)現(xiàn)基因長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定的表達(dá)，不隨細(xì)胞分裂傳代而丟失，是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，常用于構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株
② 安全性高：未發(fā)現(xiàn)致病性，慢病毒載體改造T細(xì)胞用于CAR-T細(xì)胞治療
③ 免疫原性低：直接注射活體組織不易造成免疫反應(yīng)，適用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

5.慢病毒載體應(yīng)用

5.1 體外感染細(xì)胞

慢病毒載體能夠有效地感染培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型原代細(xì)胞和大部分細(xì)胞系。慢病毒的感染具有整合特性，能夠?qū)⑼庠椿蛴行У卣系剿拗魅旧w上，因而可以達(dá)到持久性表達(dá)，從而構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株，用于基因的細(xì)胞功能研究。
體外使用慢病毒感染細(xì)胞需要注意，由于每種細(xì)胞對(duì)慢病毒的敏感性不同，有的容易感染，有的比較難，同時(shí)每種慢病毒載體熒光強(qiáng)度也有差異，所以正式實(shí)驗(yàn)前需要做病毒感染預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確認(rèn)MOI值以達(dá)到理想的實(shí)驗(yàn)效果。
MOI值是multiplicity of infection 的縮寫(xiě)，即感染復(fù)數(shù)，其含義是感染時(shí)病毒與細(xì)胞的數(shù)量比值，一般以實(shí)驗(yàn)中某個(gè)細(xì)胞，感染達(dá)到80%，定義為這個(gè)細(xì)胞的MOI值，即病毒量與細(xì)胞數(shù)的比值；加的病毒量(μl)=細(xì)胞數(shù)×MOI/滴度(…/ml) ×1000
注意：理論上MOI值越高，慢病毒感染上的可能性越大，感染效率越高，但是這樣對(duì)細(xì)胞的毒性也越大，因此，預(yù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)MOI值要在細(xì)胞成活率和感染效率中找到一個(gè)平衡點(diǎn)。一般如果MOI超過(guò)100，甚至200還感染不是，說(shuō)明慢病毒非常難感染這株細(xì)胞，甚至感染不上，考慮換一種方式，如腺病毒或電轉(zhuǎn)。

5.2 體內(nèi)構(gòu)建成瘤模型

體內(nèi)應(yīng)用時(shí)，慢病毒可以攜帶目的基因或螢光素酶基因，篩選穩(wěn)定表達(dá)的腫瘤細(xì)胞株，直接接種構(gòu)建皮下成瘤模型，或通過(guò)原位或靜脈注射等方式構(gòu)建轉(zhuǎn)移模型，活體成像檢測(cè)用于研究體內(nèi)腫瘤的發(fā)生發(fā)展或轉(zhuǎn)移等。